Eine Knockout-Maus ist eine Labormaus, bei der Forscher ein vorhandenes Gen inaktiviert oder „ausgeknockt“ haben, indem sie es durch ein künstliches Stück DNA ersetzt oder unterbrochen haben.
ÜBERSICHT
Wozu werden Knockout-Mäuse verwendet?
Wenn man die Aktivität eines Gens ausschaltet, erhält man wertvolle Hinweise darauf, was dieses Gen normalerweise tut. Der Mensch hat viele Gene mit Mäusen gemeinsam. Die Beobachtung der Merkmale von Knockout-Mäusen liefert den Forschern daher Informationen, die sie nutzen können, um besser zu verstehen, wie ein ähnliches Gen Krankheiten beim Menschen verursachen oder zu ihnen beitragen kann.
Beispiele für Forschungsarbeiten, bei denen sich Knockout-Mäuse als nützlich erwiesen haben, sind die Untersuchung und Modellierung verschiedener Arten von Krebs, Fettleibigkeit, Herzkrankheiten, Diabetes, Arthritis, Drogenmissbrauch, Angstzuständen, Alterung und Parkinson-Krankheit. Knockout-Mäuse bieten auch einen biologischen Kontext, in dem Medikamente und andere Therapien entwickelt und getestet werden können.
Viele dieser Mausmodelle sind nach dem Gen benannt, das ausgeschaltet wurde. Die p53-Knockout-Maus zum Beispiel ist nach dem p53-Gen benannt, das für ein Protein kodiert, das normalerweise das Wachstum von Tumoren unterdrückt, indem es die Zellteilung stoppt. Menschen, die mit Mutationen geboren werden, die das p53-Gen inaktivieren, leiden unter dem Li-Fraumeni-Syndrom, einer Erkrankung, die das Risiko, in jungen Jahren an Knochen-, Brust- und Blutkrebs zu erkranken, drastisch erhöht. Andere Mausmodelle werden, oft mit kreativem Gespür, nach ihren körperlichen Eigenschaften oder Verhaltensweisen benannt. So ist beispielsweise „Methusalem“ ein Knockout-Mausmodell, das sich durch Langlebigkeit auszeichnet, während „Frantic“ ein Modell ist, das sich für die Untersuchung von Angststörungen eignet.
Was sind die Nachteile von Knockout-Mäusen?
Die Technologie der Knockout-Mäuse ist zwar ein wertvolles Forschungsinstrument, doch gibt es einige wichtige Einschränkungen. Etwa 15 Prozent der Gen-Knockouts sind entwicklungsbedingt tödlich, was bedeutet, dass die genetisch veränderten Embryonen nicht zu erwachsenen Mäusen heranwachsen können. Da es keine erwachsenen Mäuse gibt, beschränken sich die Studien auf die Embryonalentwicklung, was es oft erschwert, die Funktion eines Gens in Bezug auf die menschliche Gesundheit zu bestimmen. In einigen Fällen kann das Gen bei Erwachsenen eine andere Funktion haben als bei sich entwickelnden Embryonen.
Das Ausschalten eines Gens kann auch dazu führen, dass bei Mäusen keine erkennbaren Veränderungen auftreten oder sogar andere Merkmale als bei Menschen, bei denen das gleiche Gen inaktiviert ist. So werden beispielsweise Mutationen im p53-Gen mit mehr als der Hälfte der menschlichen Krebserkrankungen in Verbindung gebracht und führen häufig zu Tumoren in einer bestimmten Gruppe von Geweben. Wird das p53-Gen in Mäusen ausgeschaltet, entwickeln die Tiere jedoch Tumore in einer anderen Reihe von Geweben. Trotz dieser Nachteile bieten Knockout-Mäuse eines der leistungsfähigsten Mittel, die derzeit für die Untersuchung der Genfunktion in einem lebenden Tier zur Verfügung stehen. Solche Studien werden die Bemühungen beschleunigen, das neu gewonnene Wissen über die Genome von Mensch und Maus in bessere Strategien zur Diagnose, Behandlung und Vorbeugung menschlicher Krankheiten umzusetzen.
Wie werden Knockout-Mäuse hergestellt?
Die Forscher beginnen mit der Entnahme von embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) aus Mäuseembryonen im Frühstadium vier Tage nach der Befruchtung. ES-Zellen werden verwendet, weil sie in der Lage sind, sich in fast jede Art von adulter Zelle zu differenzieren, was bedeutet, dass, wenn ein Gen in einer ES-Zelle ausgeschaltet wird, die Auswirkungen in jedem Gewebe einer erwachsenen Maus beobachtet werden können. Darüber hinaus können im Labor gezüchtete ES-Zellen noch bis zu 10 Jahre nach ihrer Entnahme zur Herstellung von Knockout-Mäusen verwendet werden.
Um Knockout-Mäuse zu erzeugen, verwenden die Forscher eine von zwei Methoden, um künstliche DNA in die Chromosomen in den Kernen von ES-Zellen einzufügen. Beide Methoden werden in vitro durchgeführt, d. h. in kultivierten Zellen, die unter Laborbedingungen wachsen.
Bei der ersten Strategie, dem so genannten Gen-Targeting oder der homologen Rekombination, manipulieren die Forscher gezielt ein Gen im Zellkern einer ES-Zelle. Dies geschieht in der Regel durch die Einführung eines künstlichen DNA-Stücks, das eine identische oder homologe Sequenz mit dem Gen aufweist. Diese homologe Sequenz flankiert die DNA-Sequenz des vorhandenen Gens sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts von der Position des Gens auf dem Chromosom. Die zelleigene Kernmaschinerie erkennt automatisch die identischen Sequenzabschnitte und tauscht das vorhandene Gen oder den Teil eines Gens gegen das künstliche DNA-Stück aus. Da die künstliche DNA inaktiv ist und nur eine genetische Markierung oder ein „Reportergen“ trägt, das für die Nachverfolgung bestimmt ist, wird durch den Austausch die Funktion des vorhandenen Gens eliminiert oder „ausgeknockt“.
Bei der zweiten Strategie, dem so genannten Gen-Trapping, manipulieren die Forscher wiederum ein Gen in einer ES-Zelle. Anstatt jedoch direkt auf ein bestimmtes Gen zu zielen, wird ein Zufallsverfahren angewandt. Ein Stück künstlicher DNA, das ein Reportergen enthält, wird nach dem Zufallsprinzip in ein beliebiges Gen eingefügt. Das eingefügte Stück künstlicher DNA verhindert, dass die RNA-„Spleiß“-Maschinerie der Zelle ordnungsgemäß funktioniert, wodurch das vorhandene Gen daran gehindert wird, sein bestimmtes Protein zu produzieren, und seine Funktion ausgeschaltet wird. Wie bei der ersten Strategie können die Forscher die Aktivität des künstlichen Reportergens verfolgen, um das normale Aktivitätsmuster des vorhandenen Gens in den Geweben der Maus zu ermitteln.
Sowohl beim Gen-Targeting als auch beim Gen-Trapping besteht das Vehikel, mit dem die künstliche DNA in die ES-Zellen eingebracht wird, häufig aus einem modifizierten viralen Vektor oder einem linearen Fragment bakterieller DNA. Nach dem Einbringen der künstlichen DNA werden die genetisch veränderten ES-Zellen mehrere Tage lang in einer Laborschale gezüchtet und in Mäuseembryonen im Frühstadium injiziert. Die Embryonen werden in die Gebärmutter einer weiblichen Maus eingepflanzt und entwickeln sich dort zu Mäusewelpen.
Die daraus resultierenden Mäusewelpen weisen einige Gewebe auf, in denen ein Gen ausgeschaltet wurde – jene, die von den veränderten ES-Zellen stammen. Sie verfügen jedoch auch über einige normale Gewebe, die von den nicht veränderten Embryonen stammen, in die die veränderten ES-Zellen injiziert wurden. Es handelt sich also nicht um vollständige Knockout-Mäuse. Es ist notwendig, solche Mäuse zu kreuzen, um Mäuselinien zu erzeugen, bei denen beide Kopien des Gens (eine auf jedem Chromosom) in allen Geweben ausgeschaltet sind. Die Forscher bezeichnen solche Mäuse als homozygote Knockouts.
Welche Produktionsmethode ist die beste?
Sowohl das Gen-Targeting als auch das Gen-Trapping haben unterschiedliche Stärken. Der Vorteil des Gen-Targeting besteht darin, dass die Forscher das Gen mit hoher Effizienz präzise ausschalten können, wenn die DNA-Sequenz des Zielgens bekannt ist.
Der Vorteil des Gen-Trappings ist, dass die Forscher die DNA-Sequenzen bestimmter Gene nicht kennen müssen, um sie auszuschalten. Darüber hinaus kann beim Gen-Trapping ein einziger Vektor mit hohem Durchsatz verwendet werden, um eine Reihe von Mäusen zu erzeugen, bei denen eine Vielzahl von Genen ausgeschaltet wurde.
Der Nachteil des Gen-Trappings ist, dass es nicht so effizient und spezifisch ist wie das Gen-Targeting, da nicht jedes erfolgreiche Einfügen von künstlicher DNA in ein Gen zu einem Funktionsverlust führt. Die Forscher müssen oft viel Zeit für Tests aufwenden, um die ES-Zellen zu identifizieren, in denen tatsächlich ein oder mehrere Gene ausgeschaltet wurden. Da es sich beim Gen-Targeting um einen Zufallsprozess handelt, kann es außerdem vorkommen, dass bestimmte Gene aus statistischen Gründen oder weil das Gen in den ES-Zellen nicht aktiv ist, nicht getroffen werden, was bedeutet, dass sie den Marker, der anzeigt, dass das Gen ausgeschaltet wurde, nicht produzieren.
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